二乙烯亚胺对猪细小病毒的灭活作用来源：bob官方网站    发布时间：2025-08-14 08:24:35

　　,1.中国农业科学院家禽研究所,扬州225003;2.扬州优邦生物制药有限公司,扬州225008,

　　摘要,使用新型灭活剂二乙烯亚胺(binaryethylenimine,BEI)对猪细小病毒,Porcineparvovirus(PPV)进行了灭活试验,通过ST传代细胞接种法观察病毒灭活后出没出现细胞病变,并结合血凝试验检测灭活效果,确定最佳灭活方法。用3~5日龄乳鼠检测BEI灭活后的病毒培养物和相应制备疫苗的安全性,并用豚鼠检测该灭活工艺制备疫苗的效果,与传统甲醛灭活进行了比较。结果显示,终浓度为1‰的BEI在32℃情况下经20h即可彻底灭活PPV病毒,BEI灭活的病毒制备的疫苗免疫豚鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体。

　　猪细小病毒病是由猪细小病毒,Porcineparvovirus(PPV)感染猪引起的胚胎感染及死亡,而母猪并不表现明显症状的猪繁殖障碍性疾病。PPV为具有血凝性的单股DNA病毒,是当前引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,妊娠前期的母猪易感染,主要引起母猪流产、胎儿死亡、胎儿畸形、木乃伊胎、弱胎及不孕等,同时还可引起仔猪发生皮炎和腹泻等。本病目前已广泛分布于世界各地,并呈现出与猪蓝耳病毒、圆环病毒感染、猪伪狂犬病

　　毒以及猪瘟病毒混合感染的严重态势,给全球范围内的养猪业造成了极大的损失。目前,对于由PPV引起的猪繁殖障碍尚缺乏有效的治疗方法,唯一的防制措施就是对易感猪进行疫苗免疫,现在国内外应用的主要疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗。伴随着当今养猪业日益规模化和集约化的发展,加之灭活疫苗的生产的基本工艺简单、安全、使用起来更便捷、易于保存、能刺激动物产生高滴度抗体和显著的免疫保护效果等优点。因此开发优质高效的猪细小病毒灭活疫苗

　　PPV灭活疫苗的研制中,应用的灭活剂有、β-丙内酯(β-PL)、AEI(N-乙酰乙烯亚胺)等。有研究人员用灭活病毒制成的疫苗,诱导免疫动物产生了较高滴度的抗体,但保护效果不理想[1]。潘雪珠等[2]比较了和AEI的灭活效果,证实AEI优于。Joo等[3]用β-丙内酯灭活的疫苗,可使猪产生的抗体至少持续4个月以上。微生物灭活剂是影响PPV灭活疫苗效果的主要的因素,在灭活彻底的前提下,最大限度地保持微生物原有的抗原性是灭活剂选择的重要技术指标。我们选用了新型灭活剂二乙烯亚胺,binaryethylenimine(BEI)进行了PPV的灭活试验,并与常用灭活剂进行了比较,现将试验内容和结果报告如下。

　　1.1.1培养基、血清DMEM培养基购自SIGMA公司,犊牛血清购Hyclone公司,猪细小病毒标准阳性血清购自美国VMRD公司,阴性血清由本所研发中心实验室制备和保存。

　　1.1.3主要生化试剂胰酶购自GIBCO公司,BEI购自FLUCA公司,甲醛购自国药集团化学试剂有限公司,其它试剂均为国产或进口分析纯级。

　　1.1.4实验动物3~5日龄乳鼠购自扬州大学比较医学中心,豚鼠购自北京梅里亚维通实验动物科技有限公司,断奶仔猪购自江苏兴化隆康畜禽养殖有限公司。

　　1.2.1.1BEI的环化用0.2mol/L的NaOH溶液配制一定浓度的BEI灭活剂,在37℃恒温水浴情况下作用30~60min,NaOH溶液的pH由13降到8即为环化完全。本试验中BEI环化时的浓度分别为5%和10%。

　　1.2.1.2灭活剂BEI的毒性试验用配制好的BEI皮下注射小白鼠,每只0.1mL,共8只,同时设对照

　　组。饲养并观察14d,注射后1~3d内死亡的不计,3日后应不出现死亡或任何发病症状。

　　1.2.1.3PPV灭活试验取4瓶猪细小病毒抗原液,每瓶500mL,分别取环化浓度为5%和10%的BEI溶液做试验。根据病毒液的数量,加入配制好的BEI灭活剂,使其终浓度分别为1‰和0.5‰,然后置于32℃的恒温摇床中(120 r/min)作用。分别于灭活后20、 24、 28、 32 h用终浓度为2%的硫代硫酸钠溶液终止灭活并取样。灭活检验时每个样品做3个平行。

　　1.2.2灭活检验将所取灭活毒液样品用不含血清的细胞营养液10倍稀释后,接种已长成单层的ST细胞, 1mL/瓶, 吸附1 h后,换为含2%胎牛血清的细胞生长液培养5d,观察细胞形态及生长状况,确定有无细胞病变,cytopathic effect(CPE)出现,收获培养物,冻融3次,在ST细胞上连续传2代,同时做HA检测,观察有无凝集性。

　　1.2.3安全性试验取经灭活检验合格的PPV溶液,BEI环化浓度5% ,灭活终浓度1‰,灭活时间24h,与SEPPIC ISA 35VG佐剂按照佐剂使用说明书的提示乳化成PPV灭活疫苗。取制备的疫苗皮下注射3~5日龄乳鼠8只,每只0.1mL,观察14d, 同时设非免疫对照组。取制备的疫苗颈部肌肉注射断奶仔猪5头,每头4mL,观察21日,看有无局部或全身不良反应。

　　1.2.4免疫效力试验取制备的PPV灭活疫苗,肌肉注射HI阴性豚鼠4只,体重350g左右, ,每只0.5mL,分别于免疫后第2、 3、 4周采集分离血清并测定HI抗体效价。 同时用甲醛以常规方法灭活病毒液,并与前面相同的方法制备疫苗作为平行对照,同时设阴性对照。

　　2.1灭活剂BEI的毒性试验 接种BEI的8只乳鼠观察14d均健康存活,未见异常反应,表明该浓度的BEI是安全的。

　　2.2灭活检验结果 从试验结果来看,在0.2mol/L NaOH溶液中环化10%的BEI时,灭活浓度为

　　观察期内均出现不同程度的细胞圆缩、皱缩现象,有些甚至出现拉网和脱落,个别能检测到血凝价。BEI环化浓度为5%时,灭活浓度为1‰时,不同时间的灭活样品在再接种后的细胞全部生长正常,

　　亦没有检测出血凝价,灭活浓度为0.5‰时,有很小一部分接种灭活液后的细胞在观察期内出现细胞圆缩现象,极个别检测到血凝价。 BEI在灭活前后对PPV的HA价无影响。试验结果见表1。

　　注, “++++” ,细胞形态良好,形成致密单层, “+++” ,部分细胞圆缩,部分折光性稍差, 80%贴壁, “++” ,细胞形态一般,50%贴壁, “+” ,细胞形态不好, 出现皱缩、脱落, 25%贴壁

　　2.3安全性试验 制备的PPV灭活疫苗接种乳鼠, 残留的游离甲醛随疫苗注入动物机体后,会产生刺观察14d乳鼠均健活,未见任何不良反应,接种断 激性反应, 同时也使部分病毒蛋白结构破坏,进而奶仔猪后注射部位局部未见红肿、破溃等现象,亦 因蛋白结构发生变化而降低了免疫原性。未出现发病和死亡情况,表明该灭活方法灭活的病 烷化剂是另一类良好的病毒灭活剂,其作用毒制备的疫苗是安全的。 原理是破坏病原微生物的核酸,使其不再具有复制

　　2.4免疫效果试验 与采用常规灭活方法用甲醛灭 能力,但不影响其蛋白质成分的结构,能最大限度活病毒相比较,用BEI灭活的PPV病毒制备的疫 地保持病毒的抗原性。烷化剂主要有二乙烯亚胺苗接种豚鼠后产生的H I抗体更高。结果见表2。 (Binary-ethylenim ine, BEI)、 N一乙酰乙烯亚胺(N—

　　端发生作用,从而使病毒失活,丧失感染性。 甲醛 本试验用二乙烯亚胺BEI对猪细小病毒(PPV)虽具有灭活病毒快速、彻底的特点,但它属致癌物, 进行了灭活,并与传统灭活剂甲醛作对照,通过灭

　　活验证、血凝试验检测灭活效果以及安全性试验。有资料显示, AEI灭活病毒效果很好,但是AEI对人及动物机体有毒性,本身性质不稳定,且生产制作工艺复杂,在运输和保存过程中不甚方便,给生产和使用单位带来诸多不便。而BEI在温度高的情况下作用时,具有一定的毒性,通常认为在28℃~32℃时既安全又效果好。我们最终选择了在32℃进行灭活,没再次出现毒性现象, BEI的环化浓度也很关键, 当在0.2mol/L的NaOH溶液当中加入的BEI不超过5%时, BEI能够完全被环化。

　　经过一系列筛选试验,将BEI灭活PPV的工艺确定为1‰的BEI在32℃情况下灭活24h,然后用终浓度为2%的硫代硫酸钠终止效果比较好。试验

　　也证明BEI灭活不会降低PPV的血凝性,说明病毒的抗原性没有受到大的破坏, 同时动物免疫试验也证明经BEI灭活后的猪细小病毒,在维持病毒免疫原性方面优于传统的甲醛灭活法。

　　[2]潘雪珠,粟寿初,张婉华,等.猪细小病毒灭活疫苗的安全性和免疫力[J].上海农业学报( 1998)4(1) : 1-10.